Genotipagem de polimorfismos de um único nucleotídeo diretamente no soro por qPCR alelo-específico usando “amplicons” de tamanho reduzido

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2018.A importância clínica em genotipar polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) está relacionada na avaliação da suscetibilidade genética no desenvolvimento de doenças e possui foco na medicina preventiva e personalizada. Sabemos que a concentração de DNA genômico livre de células no soro é relativamente alta. Assim, neste estudo, pretendemos estimar a quantidade e avaliar o tamanho de DNA genômico livre de células no soro, testar se o soro cru (sem extração de DNA) poderia ser usado diretamente como fonte de DNA para qPCR e investigar se polimorfismos poderiam ser genotipados diretamente do soro cru isolado do sangue capilar usando uma centrífuga de papel operada pela força das mãos. Observou-se que alvos genômicos de tamanhos variados (65, 101, 202 e 688 pares de bases) poderiam ser amplificados com sucesso a partir do DNA extraído do soro, e que a quantidade de DNA genômico aumenta no soro com sua incubação na presença do coágulo à temperatura ambiente. Ademais, apenas os alvos genômicos de 65 e 101 pares de bases puderam ser amplificados a partir de soro cru (sem extração de DNA). A incubação por 4 dias à temperatura ambiente foi necessária para a amplificação de alvos maiores que 101 pares de bases. Em relação a genotipagem de SNPs, o soro foi separado com sucesso do sangue capilar usando uma centrífuga de papel e os genótipos foram atribuídos testando o soro cru, usando ARMS-qPCR com amplicons de tamanhos pequenos, que estavam totalmente de acordo com os genótipos atribuídos testando o DNA extraído do sangue capilar. Assim, o soro pode ser usado diretamente como “template” para reações de qPCR simplificando a fase pré-analítica e eliminando a etapa de extração na genotipagem de SNPs. Esses atalhos no processo podem futuramente promover diagnóstico molecular por teste laboratorial remoto (“point-of-care”).The clinical importance of genotyping single nucleotide polymorphisms (SNPs) is related to the assessment of genetic susceptibility in disease development and focuses on preventive and personalized medicine. We know that the mean concentration of cell-free genomic DNA (gDNA) in serum is relatively high.Thus, in this study, we aimed to evaluate the amount and gDNA size in serum; to test if crude serum (without DNA extraction) can be directly used as source of gDNA for qPCR and to investigate if single nucleotide polymorphisms could be genotyped directly from crude serum isolated from capillary blood using a hand-powered paper centrifuge. All tested PCR targets (65, 101, 202 and 688 base-pairs) could be successfully amplified from DNA extracted from serum irrespective of their amplicon size and the genomic DNA yields increased in serum with the incubation at room temperature. Only 65 and 101 base pairs PCR targets could be amplified from crude serum soon after the coagulation. Incubation for 4 days at room temperature was necessary for the amplification of PCR targets larger than 101 base pairs. Serum was successfully separated from capillary blood using the paper centrifuge. The genotypes assigned by testing the crude serum using ARMS qPCR producing small amplicon sizes were in complete agreement with the genotypes assigned by testing the DNA extracted from whole blood. Thus, the serum could be directly used as template in qPCR simplifying the pre-analytic phase and eliminating the extraction steps of the SNP genotyping. These shortcuts in the process could promote in the future molecular point-of-care diagnostics